Le origini del convento si fanno risalire al 1316 quando per la prima volta venne ricordato come "Monastero, ovvero Romitorio in Campo Corbolini" ove si erano stabilite le suore eremitane.
Le Monache di San Martino al Mugnone, divenute nel frattempo proprietarie del convento, lo cedettero alle due fondatrici delle Terziarie Francescane provenienti da Foligno: Suor Onofria dei conti d'Abruzzo e suor Giovanna d'Onofrio degli Onofri.
In quell'occasione il convento venne ampliato e abbellito e successivamente, Lorenzo il Magnifico vi fece costruire il dormitorio.
Ulteriori ampliamenti vennero effettuati nel XVII secolo.
Nel 1800, con le prime soppressioni napoleoniche, le monache di "Fuligno" si trasferirono in Sant'Ambrogio.

     Dopo essere stato assegnato al Seminario Fiorentino, successivamente, con rescritto granducale del 5 febbraio 1829, nell'antico monastero di Sant'Onofrio" viene fondato l'Educatorio della Santissima Concezione detto di "Fuligno" destinandolo all'educazione cristiana e civile di fanciulle povere di Firenze e specialmente orfane".

     Nel 1845, dopo la scoperta del famoso affresco con l'ultima cena, celato sotto un intonaco, il refertorio venne trasformato in museo. ll governo granducale, dopo aver restaurato la fabbrica, vi traferi la Collezione Rossellini facendone un museo di arte egizia.

     L'affresco raffigura l'Ultima Cena, con Cristo al centro e gli Apostoli seduti alla sua destra e alla sua sinistra, identificati dai nomi scritti ai piedi di ciascuno sulla pedana; dall'altro lato lungo della tavola siede Giuda. L'iconofrafia segue la rappresentazione tradizionale del tema trattato da Taddeo Gaddi in Santa Croce, da Andrea del Castagno a Sant'Apollonia, dal Ghirlandaio a San' Marco, diverso e invece lo sfondo ove, tra i pilastri di una finta navata in prospettiva, spazia una bella campagna di carattere umbro, al cui centro e' rappresentata l'Orazione neIl'Orto.

     L'affresco attribuito inizialmente a Raffaello e' oggi riferito a collaboratori del Perugino tra i quali Giovanni di Bartolomeo, detto Rocco Zoppo, che l'eseguirono su un disegno fatto dal maestro durante i suo soggiorno fiorentino della fine del Quattrocento.
Il dipinto e' incorniciato da una fascia decorativa interrotta da sei tondi, cinque dei quali contengono i busti di santi francescani: un vescovo, Sant'Antonio da Padova, San Francesco, San Bernardino, San Ludovico di Tolosa, mentre quello inferiore centrale reca il monogramma cristologico bernardiniano.

     Nel 1871 l'allestimento museale fu esteso ed altri ambienti adiacenti al cenacolo, per ospitarvi il Museo Etrusco, ma ben presto anche tale soluzione risulto inadeguata e nel 1880 tutte le antichita egizie ed etrusche vennero trasferite al Palazzo della Crocetta.

     Dopo che il Cenacolo fu invaso dall'alluvione del 1966, fu risanato e restaurato, i locali vennero utilizzati per ospitarvi numerosi dipinti alluvionati. Soltanto recentemente (1990), grazie al cospicuo finanziamento del Ministero per il Beni Culturali, il Cenacolo di Fuligno e' stato riproposto non solo come contenitore del celebre affresco del Perugino ma anche come spazio rappresentativo del trecentesco monastero di Sant'Onofrio nel quale sono esposte e valorizzate opere d'arte dell'ex convento.